Цитогенетические исследования (хромосомный анализ)

Кариотипирование — Цитогенетический метод

Каждый организм характеризуется определенным набором хромосом, который называется кариотипом. Кариотип человека состоит из 46 хромосом — 22 пары аутосом и две половые хромосомы. У женщины это две X хромосомы (кариотип: 46, ХХ), а у мужчин одна Х хромосома, а другая — Y (кариотип: 46, ХY). В каждой хромосоме находятся гены, ответственные за наследственность. Исследование кариотипа проводится с помощью цитогенетических и молекулярно-цитогенетических

Кариотипирование при бесплодии показано в следующих случаях:

• Необструктивная азооспермия
• Тяжелая олигозооспермия (<5 млн/мл).
• Задержка полового развития
• Первичная аменорея
• Вторичная аменорея (преждевременная менопауза)
• Привичное невынашивание раннего срока беременности (наличие 2 и более самопроизвольных абортов в первом триместре беременности) — обследуются оба родителя. В семьях с отягощенным акушерским анамнезом (привычное невынашивание, особенно ранних сроков, мертворождение, рождение ребенка с множественными врожденными пороками развития (МВПР) — хромосомные нарушения встречаются от 5 до 15% случаев
• Обследование доноров спермы и яйцеклеток.

Аномальные кариотипы и хромосомные болезни

Нарушения нормального кариотипа у человека возникают на ранних стадиях развития организма: в случае, если такое нарушение возникает при гаметогенезе, в котором продуцируются половые клетки родителей, кариотип зиготы, образовавшейся при их слиянии, также оказывается нарушенным. При дальнейшем делении такой зиготы все клетки эмбриона и развившегося из него организма обладают одинаковым аномальным кариотипом.

Однако нарушения кариотипа могут возникнуть и на ранних стадиях дробления зиготы, развившийся из такой зиготы организм содержит несколько линий клеток (клеточных клонов) с различными кариотипами, такая множественность кариотипов всего организма или отдельных его органов именуется мозаицизмом.

Как правило, нарушения кариотипа у человека сопровождаются множественными пороками развития; большинство таких аномалий несовместимо с жизнью и приводят к самопроизвольным абортам на ранних стадиях беременности. Однако достаточно большое число плодов (0.5% с аномальными кариотипами донашивается до окончания беременности.

• Молекулярно-цитогенетические исследования: FISH, SKY
• Молекулярно-генетические исследования (анализ ДНК)
• микроделеций Y-хромосомы (AZF-фактор)
• муковисцидоза (гена CFTR)
• адреногенитального синдрома (гена CYP21)
• фенилкетонурии (гена PAH)
• фрагильной Х-хромосомы (гена FMR1)
• предрасположенности к нарушениям гемостаза и невынашиванию беременности (генов FII, FV, MTHFR, ITGB3, GSTM1, GSTT1)

Микроделеций Y-хромосомы (AZF-фактор)

В 1976 г. Tiepolo и Zuffardi впервые показали существование на Y хромосоме генов ответственных за регуляцию сперматогенеза. Они были определены как факторы азооспермии (AZF)

Микроделеция Y хромосомы — это выпадение определенных участков Y хромосомы — AZF локуса (фактора азооспермии). AZF локус находится в длинном плече Y-хромосомы (Yq11). Гены, расположенные в этом локусе, играют важную роль в процессе сперматогенеза.

Исследование микроделеции локуса AZF Y хромосомы в ряде случаев позволяет:

• установить генетическую причину нарушений сперматогенеза; — проводить дифференциальную диагностику бесплодия у мужчин;
• корректировать терапевтические подходы, избегая «лишнего» лечения, а также;
• прогнозировать возможность получения сперматозоидов для ИКСИ или ЭКО;
• прогнозировать возможность получения сперматозоидов при тестикулярной биопсии;
• прогнозировать для потомства мужского пола возможность наследования репродуктивных проблем отца;
• рекомендовать использование предимплантационной диагностики для исключения наследования репродуктивных проблем отца.

Бесплодием страдают около 25% супружеских пар, при этом примерно в 60% случаев оно обусловлено нарушением репродуктивной функции со стороны мужчин. Бесплодие у мужчин в 40-50% случаев может быть связано с нарушениями количественных и/или качественных показателей эякулята. Примерно у 31,7% мужчин причину бесплодия установить не удается (идиопатическое бесплодие). Предполагается, что большая его часть и обусловлено генетическими или иммунологическими факторами.

Сперматогенез представляет собой сложный многоэтапный процесс, завершающийся образованием зрелых мужских половых клеток — сперматозоидов.

Данный процесс контролируется большим количеством генов, расположенных как на аутосомах, так и на гоносомах (половых хромосомах), в особенности на Y-хромосоме. Мутации генов, контролирующих этапы сперматогенеза, могут приводить к нарушению подвижности, морфологических и фертильных свойств сперматозоидов, блоку сперматогенеза, проявляясь в диапазоне от легкого снижения сперматогенной активности до полного отсутствия половых клеток в семенных канальцах (синдром «только клетки Сертоли»).

В механизме возникновения Y-микроделеций ясно, что основной причиной высокой частоты микроделеций Y-хромосомы является ее нестабильность и склонность к потере генетического материала. Это может быть обусловлено наличием большого числа различных повторов (Alu-повторов и др.), действием мобильных генетических элементов (эндогенных вирусов и др.), а также потерей генетического материала в случаях аберрантной рекомбинации между гомологичными областями X- и Y-хромосом или несбалансированными обменами между сестринскими хроматидами Y-хромосомы.

Исследования ДНК Y-хромосомы показали ее высокую полиморфность. Вероятно, некоторые субъекты в большей мере, чем другие, склонны к возникновению Y-микроделеций вследствие особенностей структуры Y-хромосомы у них, носительством полиморфизмов ДНК, предрасполагающих к таким потерям.

Так, микроделеции локуса AZF (Azoospermia Factor, фактор азооспермии) хромосомы Y обнаруживаются в среднем в 10-15% случаев азооспермии и в 5-10% случаев олигозооспермии тяжелой степени и обусловливают нарушения сперматогенеза и бесплодие у мужчин. AZF-локус содержит три неперекрывающихся субрегиона: AZFa, AZFb и AZFc. Каждый из них содержит ряд генов, мутации которых приводят к азооспермии или олигозооспермии тяжелой степени.

Делеции AZFa- и AZFb-субрегионов ассоциированы с невозможностью получения зрелых половых клеток, а у пациентов с AZFс-делециями примерно в 71% случаев удается получить зрелые сперматозоиды. Так как, у пациентов с AZFс-микроделециями часто отмечается прогрессирование нарушений сперматогенеза от олигозооспермии до азооспермии с возрастом, то есть при нормальном сперматогенезе в 20 лет, полная азооспермия в 35 лет. Таким пациентам необходима криоконсервация полученных сперматозоидов.

Обобщение многочисленных данных литературы показывает, что AZF-микроделеции обнаруживаются у 7,3% мужчин с бесплодием. Большая часть (66%) микроделеций найдена у пациентов с азооспермией, в 28% случаев — у пациентов с олигозооспермией тяжелой степени.

Выбор пациентов для проведения микроделеционного анализа

• Так как, чаще всего, микроделеции обнаруживаются у мужчин с идиопатическим бесплодием (бесплодием неясного генеза), то им в первую очередь показано обследование AZF-локуса на наличие микроделеций.
• Данное исследование необходимо проводить всем мужчинам перед планируемым ИКСИ из-за высокого риска передачи Y-микроделеций сыновьям.
• Кроме того, исследование AZF-локуса на наличие микроделеций должно выполняться у мужчин с показателем количества сперматозоидов менее 5 млн/мл, т. е. с азооспермией или олигозооспермией тяжелой степени.

Репродуктивные технологии и AZF-микроделеции

• Применение репродуктивных технологий (ВРТ), и, в частности, такого метода, как ИКСИ, позволяет части пациентов с микроделециями AZF-локуса иметь потомство, однако плоды мужского пола имеют высокий риск наследования Y-микроделеций, соответственно, репродуктивных проблем отца.
• Пациентам с AZF- микроделецией Y хромосомы возможно рекомендовать использование предимплантационной диагностики пола эмбриона при применении ЭКО с целью переноса эмбрионов женского пола, которым невозможна передача наследования данного вида бесплодия.
• Пациенты должны быть информированы для принятия решения о применении ВРТ.
• Делеции AZFa- и AZFb-субрегионов ассоциированы с невозможностью получения зрелых половых клеток, таким образом, при проведении диагностической биопсии у данных пациентов получить сперматозоиды невозможно. Следовательно, данным пациентам необходимо рекомендовать иные пути решения репродуктивных проблем: донорские программы или усыновление.
• У пациентов с AZF с-делециями примерно в 71% случаев удается получить зрелые сперматозоиды.
• Наличие AZF- микроделеций обусловливает неэффективность консервативного лечения, направленного на повышение сперматогенеза (увеличение количества сперматозоидов), однако при AZF с — делеции при подготовке к ВРТ необходима терапия, направленная на коррекцию гормонального и метаболического статуса мужчины для получения морфологически качественных сперматозоидов.
• Так как, у пациентов с AZF-микроделециями часто отмечается прогрессирование нарушений сперматогенеза от олигозооспермии до азооспермии, таким пациентам необходима криоконсервация полученных сперматозоидов (даже единичных).

Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД)

• ПГД числовых хромосомных нарушений
• ПГД при транслокациях
• ПГД моногенных дефектов

При обследовании пациентов с бесплодием во многих случаях необходим комплекс генетических исследований, включающий как ДНК-анализ, так и хромосомный анализ. Ниже приводится перечень лабораторно-генетических исследований, которые наиболее часто рекомендованы при нарушениях репродуктивной функции.

Наиболее полный объем и показания для лабораторно-генетического обследования может определить врач-генетик. При выявлении генетических нарушений очень важно определить спектр дополнительного генетического обследования, если это необходимо. Дополнительное обследование может представлять собой ДНК анализ большего числа мутаций или проведение FISH-анализа на лимфоцитах или сперматозоидах пациента.

Показания к проведению генетического обследования у мужчин

1. Выраженная олигозооспермия, азооспермия
2. Выраженная астенозооспермия
3. Близкородственный брак между супругами или их родителями
4. Повторные выкидыши или рождение мертвых детей (особенно при наличии пороков развития у плода или неясной причине его гибели)
5. Врожденные пороки развития или другие наследственные нарушения у супругов или их родственников
6. Бесплодный брак у других супружеских пар данной семьи